棉塞的製作通常涉及以下步驟：
準備棉花。取適量的棉花，將其鋪展成片狀，大小應適合試管或容器口的尺寸。
摺疊棉花。將棉花片的一邊折起，再折起另一邊，形成一個柱狀。
捲動棉花。順著折起的邊捲動棉花，形成一個緊實的棉柱。
處理毛茬。將棉柱一端的棉花毛折向棉柱內部，確保棉花毛平整且緊密地貼在棉柱上。
插入試管口。將棉柱的毛茬折回的一端塞入試管口或容器口，確保棉塞在試管內的部分約占棉塞的2/3至2cm。
一個合格的棉塞應符合以下標準：
形狀規則，無溝縫，與管壁貼合緊密，能完全遮蓋管口，且棉花和瓶口之間無縫隙。
大小和鬆緊度適宜，既不能太松也不能太緊。檢查鬆緊的方法是：在試管里裝入適量的水或培養基，用手提起棉塞，棉塞不下滑且無掉落感表示鬆緊適宜。
調整細節。對於較粗的試管或容器，可以在棉塞外包裹一層紗布，以增加美觀和延長使用壽命。
不同套用（如實驗室、醫療或工業用途）可能對棉塞的材料和製作標準有特定要求。例如，一些套用可能使用再生纖維素纖維、天然纖維（如棉花、木漿）或合成纖維等。此外，棉塞的設計和製作過程可能需要根據具體套用進行相應調整。